副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus，V.parahaemolyticus）感染的爆发已成为许多国家，尤其是沿海城市的一个重大公共卫生问题。因此，开发快速、高灵敏度和特异性的V.parahaemolyticus检测方法以确保食品安全是一个巨大的需求。目前检测方法可分为传统检测方法、免疫学方法、分子生物传感器等。然而，传统的检测方法通常比较复杂和耗时。免疫学方法，如酶联免疫分析和免疫胶体金技术，需要特定的抗体保存条件。此外，现有大多数分子生物传感器的信号识别、转换和输出主要是通过核酸放大反应来设计的，可分为两种类型：一种是变温反应，即普通的聚合酶链反应（PCR）及其衍生技术，包括实时荧光定量PCR和数字PCR，虽然PCR及其衍生技术成熟且应用广泛，但这些方法需要特殊的温度过程，需要相对较长的时间和特定的大型设备。另一种是等温反应，等温反应在灵敏度、特异性和周转时间方面也存在诸多挑战。因此，以前的大多数研究集中在引入各种物质，包括甜菜碱、牛凝血酶、二 亚砜等以提高扩增效率。此外，还引入了各种纳米材料来优化核酸扩增检测技术，如金纳米颗粒（AuNP）、磁性纳米颗粒（MNPs）、氧化石墨烯和 化钛纳米颗粒，旨在提高检测性能，主要对于高特异性、高产量和高灵敏度在三个方面至关重要。尽管有一些研究试图优化等温反应，但有关其形态和增强机制的细节尚不清楚， 化硅（SiO2）纳米颗粒增强的 核酸反应是PCR。
近日，中国农业大学许文涛教授团队通过将MSN引入用于检测V.parahaemolyticus的单交叉引发扩增（sCPA）系统，设计了介孔 化硅纳米颗粒/核酸掺杂纳米花（MSN/NA掺杂纳米花）的现场单交叉引发荧光（SCPF）传感器（图1）。此外，MSN和核酸通过吸附sCPA组分聚集成更大的纳米团簇，形成MSN/NA掺杂的纳米花。因此，增加了反应组分的局部浓度，将检测时间缩短了一半左右，提高了检测灵敏度和稳定性。这满足了实际现场应用的需求，实现了对潜在有害细菌的快速、准确和灵敏检测。
图1设计原理
首先，研究者设计了V.parahaemolyticus特异性sCPA引物，并对sCPA体系成分、反应条件等分别进行了优化。为了探索MSN增强SCPF传感器，不同浓度MSN向sCPA反应中添加。与未添加MSN的样品相比，添加MSN后Ct值显著降低17-25（图2A）。随着浓度的增加，Ct值逐渐降低，而放大效率逐渐提高。当浓度达到0.2mg/mL，Ct值基本保持不变。因此，MSN的 浓度为0.2mg/mL。此外，向反应中添加AuNPs和MNP，发现其对SCPF传感器没有明显的增强效果。为了探索sCPA引入MSN的灵敏度，在 反应条件下测试了不同浓度的V.parahaemolyticus。比较Ct值与V.parahaemolyticus不同浓度之间的关系。如图2B所示，Ct值与V.parahaemolyticus浓度对数之间存在良好的线性关系，表明SCPF传感器具有较低的检测限、较宽的检测范围和较高的灵敏度。然而，不含MSN的sCPA的灵敏度表现出较差的重复性，灵敏度较低（图2C）。有趣的是，MSN的引入缩短了检测时间，提高了检测效率，提高了检测灵敏度。
接着，为了实现对V.parahaemolyticus的现场、快速和便携式检测，构建了一个由笔记本电脑操作的PCR管荧光阅读器（图2D），其中最重要的部分是PCR管样品室、激光发射模块、光电倍增管、二色镜、电路室和遮光罩。将含有荧光信号的PCR管放置在与二向色镜模块相连的封闭样品室中，改变光路。激光发射模块安装在分色镜盖的水平方向上。激光发射模块在水平方向上发出的光通过二向色镜变为垂直反射光，并在PCR管中照射。接收光电路模块沿直线方向接收、聚焦和过滤反射光，将获得的光信号转换为电信号，并通过集成电路板处理电信号。然后通过计算机上的程序软件直接读取数据。PCR管荧光阅读器的操作步骤分为三个步骤。 步是打开电源和连接到电脑；第二步是将含有反应受试物的PCR管放入PCR管样品室，并关闭遮光罩；第三步是打开计算机上开发的软件，开始测量并获得数值。此外，为了保证荧光值的稳定性和准确性，在最外层设计了具有良好遮光性能的遮光罩。
图2MSN增强传感器及设备搭建然后，为了探索MSN/NA掺杂的纳米花形成，通过扫描电镜（SEM）观察其表面形貌，MSN/NA掺杂的纳米花具有不规则的3D形状，最外层有一层薄膜，相交表面有棒状结构，类似于一个厚花骨架。利用TEM观察了MSN/NA掺杂纳米花的内部结构，与SEM一致，MSN/NA掺杂的纳米花显示出不规则的3D形状，最外层上有一层薄纱膜和从内到表面相交的杆状结构（图3C和D）。有趣的是，MSN/NA掺杂纳米花的SAED图案显示了以透射点为中心的衍射环的存在，表明晶体结构的形成（图3E和F）。通过STEM分析MSN/NA掺杂的纳米花成分，表明MSN/NA掺杂的纳米花含有P、O、Si、N和Mg（图3G）。为了研究MSN促进sCPA的机理，利用琼脂糖凝胶分析（图2H）、条带密度分析和峰面积分析，与带有MSN的增强sCPA（通道5）相比，MSN吸附几乎所有单一组分，但程度不同。单链引物靶带的灰度值显著减弱（通道1），表明MSN吸附了大量单链引物，而dNTPs表现出类似的大量吸附现象（通道8）。当被双链模板（通道2）、MgSO4（通道3）和甜菜碱（通道4）取代时，sCPA的靶带相对较弱，表明MSN吸附了少量双链模板、MgSO4和缓冲液。当用缓冲液（通道6）、Bst2.0聚合酶（通道7）替换时，sCPA产物的减少不明显，表明MSN在其上的吸附较少。因此，MSN对sCPA组分的吸附能力如下：单链引物dNTPs双链模板MgSO4甜菜碱Bst2.0聚合酶缓冲液。
图3纳米花的形成及机理分析
，研究了不同时间、不同MSN浓度、MSN孔对纳米花的影响。在时间上，在反应之前，MSN呈现为直径为50nm的球体（图4A）。MSN被引入sCPA系统，15min后，MSN开始聚集，在表面形成一层（图4B和C）。然后，30min后聚集的MSN增长为更大的集群结构（图4D和E）。再过45min，褶皱和堆叠的形状开始出现，可能形成了MSN/NA掺杂的纳米花原型（图4F和G）。60min后，约2mm的MSN/NAdoped纳米花形成，并被未反应的圆形MSN包围（图4H和I）。这些结果表明，MSN促进了sCPA扩增子在MSN表面的生长。在浓度上，不同浓度的MSN参与反应，产物均形成纳米花。当MSN浓度增加时，MSN/NA掺杂纳米花的表面吸附了更多未反应的圆形MSN（红色箭头），sCPA增强效应随浓度增加而增强。然而，浓度为0.3mg/mL时，其对sCPA的影响下降，表明显著升高的MSN浓度不会产生更强的增强效果，而 浓度是最重要的。此外，当MSN浓度达到1mg/mL，纳米花不断增加，在现有的纳米花上形成额外的纳米花（红色箭头）。在没有MSN和无孔 化硅的情况下检查样品的形态。与未添加MSN的样品相比，添加MSN形成的纳米花的形状更容易观察，而纳米花骨架更明显，花瓣更明显（图6A和B）。与未添加 化硅的样品相比，添加纳米 化硅的样品显示出更好的形貌。通过该介质形成的纳米花上几乎没有未反应的非多孔 化硅吸附，大多数留在纳米花周围，这表明MSN选择性地吸附在反应组分上，而反应组分在孔隙和不均匀的MSN表面上有更好的吸附。“孔”表现出更强的吸附，影响纳米花的形态（图6C和D）。
图4不同时间形成的纳米花图5不同浓度MSN对纳米花形成的影响图6 化硅“孔”对纳米花形成的影响总之，本手稿搭建的生物传感器具有以下三个优点：（1）对传感器有增强的效果。首先，开发了MSN/NA掺杂纳米花增强型SCPF传感器，以提高检测灵敏度，提高检测效率，增加对V.parahaemolyticus的重复性，将检测时间减少约一半。（2）MSN的吸附。MSN通过吸附组分来增强SCPF传感器。MSN优先吸附单链引物和dNTPs，而不是双链模板，缓冲液的吸附较弱。（3）分析了纳米花的形态。sCPA组分促进了MSN的形态聚集成更大的MSN/NA掺杂纳米花，发现并分析了纳米花的组成。（4）现场和等温检测。该传感器可在恒温条件下运行，设计的PCR管荧光阅读器解决了仪器笨重、成本高、专业人员多、无法实现现场检测等难题。
点评：
1．本文描述了一种简单、特异和现场荧光生物传感器的设计，用于检测副溶血性弧菌，利用纳米花增强了生物传感器。
2．本文所研制的现场检测仪器可作为检测副溶血性弧菌和其他病原体的有吸引力的实验室工具，但在临床适用性还有所欠缺，需要进一步研究稳定性以应用。
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