七八月份，走到葡萄园中，如果你看到有的葡萄叶片正面产生白色粉斑或灰白色斑块，像沾染了灰尘一样，那么你看到的就是葡萄白粉病（图1）。
葡萄白粉病是由葡萄钩丝壳菌Uncinulanecator引起的一种真菌性病害。由于其能够侵染葡萄的叶片、果穗及幼嫩枝蔓，所以每年都会造成巨大的经济损失，一般来说，会导致15%~30%的损失，严重时可以达到70%，甚至可以绝产绝收。
葡萄白粉病的发生
葡萄白粉病是什么时候开始发生的呢？是不是当我们在叶片上看见了白粉病状才开始发生了呢？其实不然，冬天的时候，葡萄白粉病菌为了自身生存，会形成闭囊壳（图2）躲藏在田间葡萄的残枝败叶中，到了第二年条件适宜的时候，形成分生孢子（图3）落到了葡萄叶片上，分生孢子萌发，葡萄叶片的免疫系统没有抵挡住葡萄白粉病菌的入侵，而后葡萄白粉病菌数量不断增加，葡萄叶片出现了白粉粉层。从病原菌入侵到叶片上出现粉层的这段时期叫做潜育期。
葡萄白粉病的发生是由葡萄、葡萄白粉病菌和环境三者共同决定的。农药的作用在于提供给葡萄白粉病菌一个不利于生存的环境，保证未发生病害的区域不发生病害，而已经发生病害区域所造成的经济损失已经无法避免了。因此尽早的检测到葡萄白粉病的田间发生对于防治葡萄白粉病具有十分重要的作用。
葡萄白粉病菌检测方法
如何及早的检测到葡萄白粉病菌？目前用于葡萄白粉病菌检测的方法主要有以下几种，一种是室内保湿培养，二是利用分子生物学手段进行检测，如实时荧光定量PCR、环介导等温扩增等方法。
葡萄白粉病菌的室内保湿培养
室内保湿培养，即将疑似感染的侵染的部位进行室内保湿培养，通过显微镜进行形态观察，确定是否侵染（图4）。
但是在进行室内保湿培养过程中，操作比较麻烦，比较耗时间并且对环境要求比较严格。
实时荧光定量PCR检测葡萄白粉病菌
实时荧光定量PCR是在PCR反应的基础上发展起来的，该技术在PCR反应体系中加入了一种可以结合到反应产物的荧光染料或荧光探针，随着PCR反应的进行，反应产物不断增加，荧光强度也不断增强，荧光定量PCR仪可以根据荧光信号的变化对检测样品进行定量检测分析。
（PCR反应：PCR即聚合酶链式反应，是一种用于放大特定DNA片段的一种方法。DNA是一种双链螺旋结构，在体外95℃时，双链发生变性形成单链，特异性引物在60℃时可以与变性形成的单链进行结合（退火），72℃在耐热DNA聚合酶（来自于火山温泉真菌）的作用下，会对特异性片段进行扩增（延伸））
年，宁夏大学石华荣等以ITS序列设计合成引物，对引物特异性进行筛选，优化了反应退火温度，建立了葡萄白粉病菌实时荧光定量PCR检测体系。并利用所建立的反应体系对人工接种的葡萄白粉病菌潜育期叶片内病原菌DNA进行定量检测，发现所建立的实时荧光定量PCR检测体系能够检测到病原菌侵入叶片6h后的低侵染量（图5）。
葡萄白粉病菌实时荧光定量检测体系特异性强，灵敏度好，重复性好，定时定量，能够满足葡萄白粉病菌早期检测的要求。
环介导等温扩增检测葡萄白粉病
环介导等温扩增是是由Notomi在年开发出的一种新型的核酸扩增方法。该技术利用1种在扩增过程中参与链置换反应的DNA聚合酶以及2对设计筛选出来的内引物FIP/BIP和外引物F3/B3，在恒温条件下（55~65℃）催化新链合成（图6）。扩增产物为一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，使得产物在琼脂糖凝胶电泳上呈现梯形条带。由于环介导等温扩增拥有极大的扩增效率，在短时间内即可实现靶序列的倍扩增，因此在加入特异性核酸荧光染料SYBRGreenI时即可实现肉眼检测，即阳性样品（含有目标物）在自然光下呈现出绿色，在蓝光仪下显示出荧光，阴性样品（不含目标物）在自然光下呈现出红色，在蓝光仪下不显示荧光。
（琼脂糖凝胶电泳：将琼脂糖溶于溶剂（TAE）中，形成一个分子筛（分子筛空隙大小由单位体积溶解的琼脂糖质量决定），核酸分子（DNA/RNA）在电流的作用下，在分子筛中运动，分子较大的，跑的较慢，反之，分子较小的，跑的较快。）
年宁夏大学刘心缘等首次建立了葡萄白粉病菌环介导等温扩增反应体系，依据葡萄白粉病菌的rDNA-ITS全长基因序列设计合成并筛选引物，发现UNITF3-3/UNITB3-3为外引物，UNITFIP-3/UNITBIP-3为内引物对葡萄白粉病菌有特异性；通过对反应体系中BstDNA聚合酶、甜菜碱、Mg2+、dNTPs、内外引物比、反应时间和反应温度等反应底物和条件进行优化，发现优化后的体系可以检测出低至10pg·μL-1葡萄白粉病菌DNA（图7）。使用优化后的反应体系对宁夏贺兰山东麓志辉源石酒庄、立兰酒庄、西鸽酒庄、新牛酒庄和宁夏枸杞研究院田间未显症叶片进行检测，发现所建立的体系能够在显症前检测到葡萄叶片中的葡萄白粉病菌（图8）。
葡萄白粉病菌环介导等温扩增检测体系操作简便，耗时较少，对于实验设备环境要求不高，适用于酿酒葡萄种植地区进行葡萄白粉病菌潜育期的检测。
文章来源
国家重点研发计划项目组专家宁夏大学教授顾沛雯
图文编辑
李子欣
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