PCR自年创造以来，使用规模逐渐拓宽，给分子生物学和分子医学带来了革命性的影响。PCR试剂供货商不断推陈出新，PCR预混液的呈现，使得PCR试验变得越来越简单便利、功能强大。研究人员只需要将模板、引物探针参加PCR预混液即可完成。不同的扩增要求只需使用不同功能的PCR预混液即可完成试验。如此简单，PCR系统里到底包含哪些秘密？
DNA模板
DNA模板的用量：用于扩增的DNA模板来历广泛，如基因组DNA、cDNA、质粒DNA、纯化后的PCR产物等，不同的模板类型和反响体系所需的模板用量不同，以50μl反响体系为例，人基因组DNA一般主张起模板量为0.1-1.0μg；大肠杆菌基因组DNA主张5-50ng；质粒或病毒DNA主张0.1-10ng。当然，模板起始量还与使用的PCR酶及Buffer的有关。
DNA模板的纯度:纯化后的DNA一般会通过分光光度计检测及，一般OD/OD比值在1.8～2.0认为DNA的纯度比较好，大于2.0或许存在RNA污染，小于1.8或许存在蛋白质污染，将影响PCR扩增效率。为了避免盐、蛋白等杂质对实验结果的影响，您能够挑选抗抑制剂能力强的PCR试剂。
引物
引物：引物是PCR技能中至关重要的一环，运用不合适的PCR引物可能会出现引物二聚体、非特异扩增等。您可能会说“引物直接提交选定的扩增区域序列到专业软件如Oligo7、Primer6等进行规划就好”，是，但也不全是，在进行编码区克隆时许多时候仍是需要您手动规划，小编主张您对引物做以下几个方面的查看，最终一定要去BLAST比对一下，确保引物的高特异性！
引物使用：终浓度通常使用0.2μM，当扩增人基因组DNA等结构复杂的序列时，建议适当减少引物用量提高特异性，如果您采用的是高保真酶进行PCR，因高保真酶具有3-5外切酶活性可能降解引物，可将引物浓度适当调高。
DNA聚合酶
Taq酶是最常见的DNA聚合酶，普通Taq酶扩增速度慢，扩增长度较短，错误率高。随着技术的发展，出现了不同功能的DNA聚合酶以适应不同的需求。例如活性更强、反应速度更快、与模板结合更牢固、高保真、“热启动“提高特异性、能进行长程扩增等。
热启动DNA聚合酶是一项非常重要的改进。非热启动的DNA聚合酶在反响体系配置时与引物在室温下产生非特异性扩增，直接影响检测准确性。热启动DNA聚合酶由于被化学润饰或抗体润饰，其活性在室温时被关闭，下降了非特异扩增。化学润饰法一般需求较长时刻的高温激活，在此过程中或许造成DNA聚合酶结构受到破坏，酶活下降；而抗体润饰的热启动酶活性首要依赖抗体润饰作用，优异的抗体润饰型热启动酶活性开释速度快，灵敏度高。
Mg2+和dNTP
Mg2+是DNA聚合酶发挥作用必须的辅助因子，有助于引物和dNTP结合，并促进引物和模板形成复合物。早期的PCR实验都难以逃脱Mg2+优化支配的恐惧，在1–4mM范围内反复测试。QIAGENPCR试剂含双阳离子，和Mg2+的配比经优化后基本无需再额外优化Mg2+。
dNTP即dATP、dCTP、dGTP和dTTP，是新链合成的质料，常见PCR反响中，各种脱氧核苷酸的常用终浓度为0.2mM。除多重PCR外，一般无需额外优化。
Buffer
任何酶发挥作用都需要特定的Buffer来提供适宜的化学环境，DNA聚合酶也不例外。8.0-9.5的pH条件是对Buffer的 要求，一些PCR增强剂的加入往往可以使PCR性能得到很大改善。
当模板中GC含量高或二级结构复杂时，还需要在Buffer中添加特殊增强剂。如DMSO、 胺、甜菜碱可以降低GC含量高的DNA变性温度，有助于引物退火，辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构； 、BSA能增加酶的稳定性。
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