PCR过程中免不了遇到各种问题，如扩不出目的条带、有非特异性条带、空白对照出现扩增产物、扩增产物跑胶弥散或拖尾、高保真PCR出现突变等等。
今天就带大家来聊一聊PCR的常见问题应该如何解决。
PCR实验包括反应体系的配置和反应程序，反应体系中有模板、引物、dNTP、酶、buffer、Mg2+，反应程序又包括预变性、变性、退火、延伸和彻底延伸。那么在PCR出现问题时主要是从反应体系的各个组分和反应程序上来进行调节优化。
Q1：PCR产物出现假阳性（即空白对照出现目的扩增产物）
Answer：1.引物设计不合适：扩增序列与非目的扩增序列有同源性，PCR也可扩增出非靶序列的序列；靶序列太短或引物太短，可导致假阳性。此时需重新设计引物。
2.为了避免靶序列受到整个基因组或大片段的交叉污染，操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂及器材应高温灭菌，所有离心管及加样枪头等均应一次性使用；必要时，加样前反应管和试剂均用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
3.为了避免靶基因受到空气中小片段核酸（与靶序列具有一定同源性）污染，可用巣式PCR方法减轻或消除。
Q2：PCR产物中出现假阴性或无扩增产物
（即阳性对照中有条带，而样品则无条带）
Answer:1.条带放置时间过久,核酸被降解， 在48h内进行电泳检测。
2.DNA模板纯度低，如含有杂蛋白质或Taq酶抑制剂，可对DNA进行再次纯化或重新用优质试剂盒提取DNA;DNA浓度太低时，可以加大模板量；对具有二级结构DNA使用较好的聚合酶；提取DNA时，避免吸入酚类试剂。
3.对设计不合理的引物进行重新设计合成；引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融而降解失效；检测引物OD值并进行电泳检测以确保两条引物浓度一致。
4.酶失活时，更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
5.PCR反应条件：提高变性/退火温度；适当增加循环次数。
6.Mg2+浓度过低可影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败，而Mg2+浓度过高会降低PCR的特异性，因而可适当提高Mg2+浓度。
7.如果靶序列发生突变或缺失时，也会影响引物和模板的特异性结合，产生假阴性结果。
Q3：非特异性条带扩增或者条带出现拖尾现象
Answer：1.当引物特异性差或引物形成二聚体时，可重新设计引物或者使用巣式PCR。
2.若模板或引物浓度过高，可适当降低模板或引物浓度。
3.酶量过多，则适当减少酶量。
4.Mg2+浓度偏高，则降低镁离子浓度。
5.退火温度偏低，适当提高退火温度或使用二阶段温度法（94℃变性，65℃左右退火与延伸）。
6.循环次数过多，不仅会降低扩增效率，且会使错误掺入率增加，因此需要减少循环次数。
Q4：PCR产物量过少
Answer：1.退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
2.DNA模板量太少。增加DNA模板量。
3.PCR循环数不足。增加反应循环数。
4.引物量不足。增加体系中引物含量。
5.延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。
6.变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。
7.DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净。
Q6：提高PCR特异性的策略有哪些？
Answer:
四种策略：
1.巣式PCR（Nest-PCR）可增加稀有靶序列的灵敏度；降低了扩增多个靶位点的可能性；提高PCR特异性。
2.递减PCR（TouchDownPCR）：前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性；循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃，直到退火温度低于Tm5℃。适合用于AFLP、DNA指纹分析等。
3.热启动PCR：抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪到达变性温度。如在冰上配制PCR反应液以抑制Taq酶活性，后将其置于预热的PCR仪中。
4.使用PCR增强剂： 胺，DMSO， ，甜菜碱等可以降低熔解温度，有助于引物退火，辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。但是增强剂的浓度要适当。
今天的技能讲解就到这里了，关于PCR的常见问题你了解了吗？祝大家都能获得满意的实验结果。
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